Takara

无标题文档

使用phi29 DNA Polymerase进行IVT模板扩增

【目的】
生产中IVT模板的制备主要通过大肠杆菌进行扩增，无法在短时间内大量获得IVT模板。本实验例展示通过使用phi29 DNA聚合酶，在短时间内大量获得IVT模板。

【方法】
使用phi29 DNA Polymerase (Code No. RR340A)，以5 ng环状FLuc BspQ I 载体作为模板，在20 μl 反应体系中，30℃下进行16 小时的RCA反应。
引物有三种：①硫代磷酸修饰3’末端随机引物#3807、②经硫代磷酸修饰3’末端的特异性引物和③未修饰的特异性引物
反应后的产物经纯化后用BspQ I 处理，分别以所得产物作为IVT模板，使用两种IVT Kit进行mRNA合成：①Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA)（Code No. 6134）；②Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（Code No. 6144）。同时，作为阳性对照，也以线性化的 FLuc BspQ I 模板质粒作为模板进行 IVT 反应。
对反应后的各样本进行mRNA产量测定和琼脂糖凝胶电泳。

试剂	原浓度	终浓度	每反应
Nuclease-free water	-	-	9 μl
10× phi29 Buffer	10×	1×	2 μl
pVAX1 P1（硫代磷酸修饰or未修饰）	100 μM	5 μM	1 μl
Poly(A) Primer R（硫代磷酸修饰or未修饰）	100 μM	5 μM	1 μl
dNTP mix	10 mM each	2 μM	4 μl
FLuc BspQ I vector（环状）		5 ng/rxn	2 μl
Total volume			19 μl

95℃　5 min、冰上放置2 min
↓
加入1 μl phi29 DNA Polymerase（10 U/μl）
↓
30℃ 16 h
↓
纯化

■ 结果表明，使用3种引物进行RCA得到的IVT模板，在产量和质量方面，都能获得与阳性对照线性化质粒相当的mRNA。
■ 但是，在使用特异性引物时，phi29 DNA 聚合酶的 3'-5' 核酸外切酶活性可能会降解引物，从而阻碍IVT模板的扩增。因此，推荐使用3' 末端经?；ば奘蔚囊铩?

附近一百元三个小时_上门服务24小时接单平台,附近约一泡50元,500元快餐4小时不限次数